BAA
О ВВЕДЕНИИ В ДЕЙСТВИЕ МЕТОДИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЙ
"ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЕРСИНИЙ, ШИГЕЛЛ И САЛЬМОНЕЛЛ
НА ОВОЩАХ, ФРУКТАХ, ЯГОДАХ"
ПРИКАЗ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
28 сентября 2010 г.
N 481
(САЗ 10-40)
В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года N 481-3-IV "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (САЗ 08-22), с изменением и дополнениями внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года N 838-ЗИД-IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики, приказываю:
1. Ввести в действие на территории Приднестровской Молдавской Республики Методические рекомендации "Обнаружение и идентификация иерсиний, шигелл и сальмонелл на овощах, фруктах, ягодах" (прилагается).
2. Считать утратившим силу подпункт "я-38" пункта 1 Приказа Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 4 сентября 2003 года N 519 "О введении в действие нормативных документов на территории Приднестровской Молдавской Республики" (регистрационный N 2676 от 23 марта 2004 года) (САЗ 04-13) с изменением, внесенным приказом Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 19 июня 2009 года N 321 (регистрационный N 4904 от 9 июля 2009 года) (САЗ 09-28) .
3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на Главного государственного санитарного врача Приднестровской Молдавской Республики Шинкарюк С.С.
4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
И. ТКАЧЕНКО
МИНИСТР
г. Тирасполь
28 сентября 2010 г.
N 481
Приложение
к Приказу Министра
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 28 сентября 2010 года N 481
Методические рекомендации
"Обнаружение и идентификация иерсиний, шигелл и сальмонелл
на овощах, фруктах, ягодах"
1. Назначение и область применения.
1. Настоящие методические рекомендации разработаны в соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года N 481-3-IV "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (САЗ 08-22) с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года N 838-ЗИД-IV (САЗ 09-32), на основании ветеринарно-санитарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Иерсиниозы", утвержденными Приказом Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 24 июня 2010 года N 279 (регистрационный N 5347 от 9 августа 2010 года) (САЗ 10-32) и в целях дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемиологического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики.
2. Настоящие методические рекомендации предназначены для врачей-бактериологов центров гигиены и эпидемиологии Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики.
3. Применение настоящих методических рекомендаций будет способствовать проведению унифицированного санитарно-микробиологического метода исследования с целью выявления патогенных энтеробактерий (иерсиний, шигелл, сальмонелл) из внешней среды.
4. В настоящих методических рекомендациях представлены: сведения по отбору, хранению, транспортировке проб, перечень необходимых питательных сред и химреактивов, схема бактериологического исследования. Схема бактериологического исследования включает "обогащение" исследуемого материала, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их серотипа, биотипа, вирулентности. Учитывая затруднения, нередко возникающие при дифференциации иерсиний с другими энтеробактериями, в методических рекомендациях представлены некоторые современные данные о биологической характеристике иерсиний - возбудителей псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Yersinia enterocolitica).
2. Общие положения.
5. Патогенные энтеробактерии (иерсинии, сальмонеллы) распространены повсеместно: они обнаруживаются в почве, пресной воде, пищевых продуктах, в организме диких и домашних животных. Обсеменение пищевых продуктов, в том числе овощей, патогенными энтеробактериями происходит при их хранении, транспортировке или технологической обработке. Обсемененность овощей не исключена в местах их выращивания в зоне природных очагов.
Длительное содержание инфицированных овощей в хранилищах сопровождается накоплением на них иерсиний. Иерсинии размножаются и длительно сохраняются на овощах, особенно в салатах из сырых овощей, хранящихся после приготовления при низкой температуре. На практике в качестве факторов передачи при иерсиниозах с наибольшей частотой отмечены салаты, содержащие сырые овощи и фрукты: капусту, морковь, репчатый лук, яблоки и др. Обсемененность овощей иерсиниями возрастает в зимне-весеннее время. В этот период иерсинии выявляются на различных предметах окружающей среды и, в первую очередь, в контейнерах и таре для овощей. Однако и в весенне-летний период на овощах нового урожая, преимущественно капусте, огурцах, помидорах, луке зеленом и других овощах, в частности, выращенных в теплицах, иерсинии также накапливаются. Условия для обсеменения овощей и окружающей среды иерсиниями создаются не только в крупных овощехранилищах, но и в небольших складах при пищеблоках.
6. Основными источниками инфекции являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Однако J. еnterocolitica для грызунов является условно-патогенным микробом. Зараженные грызуны выделяют возбудитель с калом и мочой, поэтому иерсинии могут попадать в воду, на растительность, овощи, корнеплоды и другие объекты внешней среды. В популяции грызунов передача возбудителя осуществляется алиментарным путем, через зараженный корм и воду. Источником инфекции при иерсиниозе может быть больной человек или носитель.
3. Общие сведения о бактериях рода Yersinia:
7. Иерсиниозы вызываются 5 видами возбудителей: Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.ruckeri. Патогенными для человека являются в основном первые два вида.
Возбудителем иерсиниоза является Yersinia enterocolitica, псевдотуберкулеза - Yersinia pseudotuberculosis. Особенностью этих бактерий является чрезвычайная устойчивость к низким температурам: они способны размножаться при температурах от 4 до 40 °С, в широком диапазоне pH (5,4 - 8,0) при наличии минимального количества питательных веществ, с легкостью переносят замораживание, однако при кипячении погибают в течение нескольких секунд. Основным резервуаром иерсиний является вода и почва. В воде при температуре 18-20 °С бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 40 дней, а при температуре ниже 4 °С - до 250 дней. В фекалиях бактерии выживают до 3 месяцев в замороженном состоянии и в течение 7 дней при комнатной температуре.
8. Иерсинии грамотрицательные мелкие палочки с закругленными концами (коккобактерии). Располагаются изолированно, в мазках из бульонных культур клетки могут располагаться короткими цепочками. При культивировании в жидких средах или при выделении из организма больного могут окрашиваться биполярно. Спор и капсул не образуют. Бактерии имеют жгутики, но подвижность проявляется в условиях культивирования при температуре 22-28 °С.
9. Иерсинии относятся к факультативным анаэробам. Оптимальная температура их жизнедеятельности 25-29 °C. Могут размножаться при пониженной температуре (4-10 °C), но накопление в этих условиях идет медленно. Подвижны при температуре 22-28 °C и неподвижны при 37 °C. У Y.enterocolitica подвижность более выражена. Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут в пептонной воде и на средах, используемых для выращивания энтеробактерий.
Иерсинии хорошо растут на средах: Мак-Конки, Эндо, иерсиниозной среде. Оба возбудителя способны размножаться на голодных средах (изотонический раствор хлорида натрия, фосфатно-буферный раствор и др.). На плотных средах (Эндо) при 37 °C через 24 часа образуют едва заметные прозрачные, бесцветные, с голубоватым оттенком колонии, похожие на росинки, через 48 ч при 22-28 °C образуют полупрозрачные гладкие, выпуклые, круглые, с ровными краями колонии размером от 0,1 до 1,0 мм.
На иерсиниозной среде через 24 ч иерсинии образуют мелкие круглые гладкие колонии зеленовато-синего цвета размером 0,1-0,2 мм и через 48 ч - до 2 мм с фестончатым краем и выпуклым центром на темно-голубом фоне среды. Иногда, особенно у Y. pseudotuberculosis, виден светлый голубой ободок.
На обычном агаре Y. pseudotuberculosis растут в виде более крупных неправильной формы, иногда суховатых колоний с неровными краями, а в бульоне образуют помутнение и осадок, либо осадок и поверхностную рыхлую пленку с прозрачной надосадочной жидкостью.
В условиях пониженной температуры (4-8 °C) культуры растут в S-гладкой форме. При температуре выше 28 °C Y. pseudotuberculosis диссоциирует в шероховатую R-форму, при этом имеет место полиморфизм колоний по размеру, форме и цвету, что создает впечатление роста смешанной культуры. Диссоциация Y. enterocolitica в этих условиях выражена слабо. Как правило, при выделении из организма больного человека или от животных колонии иерсиний обоих видов находятся в S-форме. Однако иногда встречаются свежевыделенные культуры Y. enterocolitica, находящиеся в R или переходной (SR или RS) формах. При культивировании Y. pseudotuberculosis на питательных средах, особенно при температуре выше 28 °C, подобные формы встречаются часто. Образование шероховатых форм обычно сопровождается изменением или даже потерей S-антигена. Такие культуры часто дают неспецифическую, спонтанную агглютинацию.
10. Типичные культуры иерсиний оксидазоотрицательные и каталазоположительные. На среде Хью-Лейфсона ферментируют и окисляют глюкозу без образования или с образованием небольшого количества газа (это свойство чаще регистрируется у J. enterocolitica серовар 09). Ферментируют маннит, маннозу, мальтозу, гидролизуют мочевину, дают положительную реакцию с метиловым красным. Не образуют сероводород, не разжижают желатин, не имеют фенилаланиндезаминазы, лизиндекарбоксилазы и аргинингидролазы. Цитрат Симмонса, малонат натрия, дульцит не утилизируют. Другие биохимические характеристики вариабельны или типичны для отдельных видов иерсиний приведены в Таблице.
Y. pseudotuberculosis ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, галактозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маннит, салицин; редуцирует нитраты и метиленовый синий. Реакции на каталазу, уреазу и с метиловым красным положительны. Реакция Фогес-Проскауэра - отрицательна (при 22-28 °C и 37 °C). Не ферментирует лактозу, сахарозу, рафинозу, дульцит, инозит, инулин.
Y.enterocolitica ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, сорбит, трегалозу; обладает уреазой и орнитиндекарбоксилазой; реакция с метиловым красным положительна. Проба Фогес-Проскауэра положительна при 22-28 °C и отрицательна при 37 °C. Не ферментирует лактозу, дульцит, рамнозу, раффинозу. Y.enterocolitica образует цистиназу (является тестом для дифференциации).
По биохимическим свойствам: ферментации ксилозы, салицина, эскулина, трегалозы, образованию индола - различают 5 биоваров Y.enterocolitica (1-5). Патогенными для человека и животных являются представители всех биоваров, но в большей степени биовары 3 и 4.
Таблица
Основные биохимические свойства иерсиний
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
| Тест или субстрат | Y.pseudotuberculosis | Y.enterocolitica | Y.frederiksenii | Y. intremedia | Y. kristensenii | Y. ruckeri | Hafnia | Proteus |
| | | | | | | | | rettgerei |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Глюкоза | + | + | + | + | + | + | + | + |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Лактоза | - | - | -/+ | -/+ | - | - | - | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Мальтоза | + | + | + | + | + | + | + | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Маннит | + | + | + | + | + | + | + | + |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Сахароза | - | +/- | + | + | - | - | - | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Рамноза | + | -/+ | + | + | - | - | + | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Сорбит | - | +/- | -/+ | + | + | +/- | - | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Мочевина | + | +/- | +/- | +/- | +/- | - | - | + |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Реакция Фогес- | - | +/- | + | + | - | +/- | +/- | - |
| Проскауэра 22- 28°C | | | | | | | | |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Реакция Фогес- | - | - | - | - | - | - | +/- | - |
| Проскауэра 37°C | | | | | | | | |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Подвижность 22 -28°C | + | + | + | + | + | + | + | + |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Подвижность 37°C | - | - | - | - | - | - | +/- | -/+ |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Салицин | + | +/- | + | + | -/+ | - | -/+ | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Индол | - | +/- | + | + | в | - | - | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Ксилоза | + | +/- | + | + | + | - | + | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Трегалоза | + | + | + | + | + | + | + | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Цитрат Симмонса | - | - | +/- | +/- | - | - | +/- | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Арабиноза | + | + | + | + | +/- | +/- | в | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Фенилаланин | - | - | - | - | - | - | - | + |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Лизин | - | - | - | - | - | - | + | - |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Орнитин | - | + | + | - | +/- | + | +/- | в |
|----------------------|----------------------|------------------|-----------------|---------------|-----------------|------------|--------|-----------|
| Цистиназа | + | + | в | в | в | в | - | - |
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Примечание: +/- преобладает положительная реакция; -/+ преобладает отрицательная реакция; в - вариабельный признак.
4. Методы отбора, хранения и транспортировки проб овощей, фруктов,
ягод.
11. Объектами для отбора проб могут служить склады, овощехранилища, овощные магазины, тепличные комбинаты, пункты приема и переработки овощей, фруктов и ягод, пищеблоки детских дошкольных учреждений, школ, лечебно-профилактических учреждений.
Для отбора проб используется стерильная посуда, целлофановые пакеты. Количество отобранной пробы составляет 0,250 - 0,500 кг. При отборе проб следует отбирать овощи, фрукты и ягоды, подвергнутые гниению, особенно капуста, лук, морковь. Кроме пищевых продуктов производят отбор смывов с оборудования, инвентаря и спецодежды рабочего персонала.
Отбор проб и доставку материала для исследования проводят специалисты центров гигиены и эпидемиологии (санитарные врачи или их помощники), как в плановом порядке, так и по эпидемиологическим показаниям.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно, но не позднее двух часов после их отбора. При непредвиденных обстоятельствах допускается временное хранение проб в холодильнике при температуре от 4 до 8 °C.
12. На отобранные пробы оформляют сопроводительный документ содержащий:
а) наименование пробы, количество, от какой партии;
б) место отбора проб, наименование предприятия, адрес;
в) дату и время отбора, а также дату и время доставки пробы в лабораторию;
г) цель исследования (текущий санитарный контроль или по эпидемиологическим показаниям), наименование нормативного документа (НД);
д) фамилия, должность специалиста, проводившего отбор проб.
5. Методы санитарно-бактериологического исследования:
13. Для выяснения роли овощей, фруктов, ягод в распространении кишечных инфекций, мест их инфицирования, с целью разработки и осуществления эффективных противоэпидемических мероприятий особое значение имеют санитарно-бактериологические исследования. Схема бактериологического исследования включает "обогащение" исследуемого материала при низкой температуре, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их серотипа, биотипа, вирулентности.
14. Исследуемый смыв в: изотоническом растворе хлорида натрия (ИХН), фосфатно-буферным раствором (ФБС) или в среде Серова - в количестве 10 мл помещают в холодильник (4- 6 °C) на 30 дней. За это время делают посевы на пластинчатые среды (Эндо, Иерсиниозная среда) в день поступления и в дальнейшем еженедельно.
Посевы на плотных питательных средах инкубируют при 30 °C в течение 18 - 24 часов, и дополнительно при 22 - 25 °C на 24 часа. Просматривают чашки с посевами через 24 - 48 часов инкубации и оценивают рост колоний. На среде Эндо через сутки иерсинии вырастают в виде мельчайших точечных, с голубоватым оттенком колоний. Через двое суток колонии увеличиваются в размерах до 2,0 - 2,5 мм, приобретают розовато-желтый оттенок, особенно в центре. К этому времени среда Эндо, как правило, краснеет, однако на участках массивного роста иерсиний цвет ее не изменяется. На иерсиниозной среде - колонии зеленовато-синего цвета. Возбудители псевдотуберкулеза через 18 - 24 часа образуют, в основном, мелкие (1,0 - 1,5 мм) выпуклые колонии. Через двое суток колонии увеличиваются в размерах до 2,0 - 2,5 мм, становятся выпуклыми, в падающем свете - суховатые матовые с перламутровым блеском. Они могут быть почти круглыми со слегка выпуклым сосцевидным центром, иметь вид многогранных пирамидок, ватрушек. Иногда встречаются распластанные колонии неправильной амебовидной формы или колонии с выпуклым центром и плоской периферической зоной. Все они блестящие и имеют характерную исчерченность, более выраженную в центре. При снятии колонии крошатся. По внешнему виду и размерам иерсинии резко отличаются от крупных колоний кишечной флоры, но трудно дифференцируются от мелких колоний некоторых других микроорганизмов, не разлагающих лактозу и находящихся в гладкой форме.
Подозрительные колонии с плотных питательных сред отсевают на дифференциальную среду Олькеницкого не менее 3 - 5 колоний, инкубируют 24 часа при 37 °C.
При первичной идентификации культур оценивают характер роста на дифференциальных средах, образование сероводорода, кислоты (щелочи), газообразование. Изучают морфологические и тинкториальные свойства культур.
Для выделения иерсиний необходимо идентифицировать все культуры, которые в дифференциальной среде не образуют сероводород и значительного количества газа.
Подозрительные культуры пересевают в две пробирки с полужидким (0,4 %) агаром, по одной пробирке с мочевиной, малонатом натрия, цитратом, маннитом, дульцитом, среду с фенилаланином, скошенным питательным агаром. Устанавливают бумажку на индол. Одну пробирку с полужидким агаром инкубируют при 22 - 28 °C, остальные - при 37 °C в течение 24 часов.
15. Идентификация иерсиний основана на определении подвижности и биохимических свойств. Культуры подвижные при 22 - 28 °C и неподвижные при 37 °C, мочевина положительные, малонат отрицательные, дульцит отрицательные, и цитрат вариабельные оцениваются как иерсинии, так как перечисленные особенности свойственны видам только этого рода и они достаточны для идентификации культур в практической лаборатории.
Для определения вида иерсиний культуры пересевают в среды с сахарозой, рамнозой, сорбитом, мальтозой, полужидкой глюкозой, салицином, лактозой, ксилозой и среду Кларка (для постановки реакции с метиловым красным и Фогес - Проскауэра) и другие тесты. Посевы инкубируют при 37 °C 24 часа. Учитывают изменения в средах и окончательную идентификацию культур проводят в соответствии с таблицей настоящих методических указаний.
16. Для ускорения выделения иерсиний целесообразно часть первичного материала обработать низкой температурой сразу. Смывы с предметов, взятых в пищеблоках, пробы готовых блюд (содержащие теплолюбивую флору) помещают в холодильник при температуре - 20 - 30 °C на 30 мин - 1 час или в морозильную камеру бытового холодильника (-10 - 15 °C) на 18 - 24 часа. После этого пробирки переносят в холодильник при температуре 6-10 °C на 4 часа (для предотвращения растрескивания пробирок), затем помещают в термостат при температуре 22 - 25 °C на 18 - 24 часа. Затем производится однократный высев на агар Эндо или иерсиниозной среде. Дальнейший ход идентификации идентичен вышеописанной методике.
Пробы смывов с овощей и различных объектов, взятых в овощехранилищах, пробирки с землей и водой, заморозке не подвергают, а помещают сразу в холодильник при температуре 6-10 °C на 18 - 24 часа.
17. В стерильную посуду помещают исследуемую пробу и, встряхивая, отмывают её 400 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН) или фосфатно-буферным раствором (ФБС). Посевным материалом является вся смывная жидкость, полученная при смыве 2/3 доставленной пробы.
Для определения наличия шигелл и сальмонелл на овощах, фруктах, ягодах, смывную жидкость исследуют тремя методами: прямого посева на плотные среды, обогащение в жидкие среды и фильтрацией через мембранные фильтры (МФ):
а) метод прямого посева: 0,2 мл исследуемой смывной жидкости засевают на плотные дифференциально-диагностические среды: Эндо, Плоскирева (SS-агар), ВСА, (не менее двух чашек каждой из сред), засеянный объем втирают шпателем. Посевы инкубируют при температуре 37 °C 18 - 20 часов. Выросшие колонии сальмонелл, шигелл подвергают идентификации по общепринятой схеме;
б) метод обогащения в жидкие среды накопления: используют не менее двух сред накопления. Для шигелл, сальмонелл - селенитовый бульон и 20 % желчный бульон или магниевую среду и селенитовый бульон.
Смывную жидкость засевают в соотношении 1: 1, (т.е. смывную жидкость вносят по 100 мл в среды двойной концентрации, разлитой по 100 мл во флаконы).
Для получения сред обогащения двойной концентрации соответственно уменьшают вдвое объем дистиллированной воды. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. По окончании инкубации из сред обогащения делают высевы на Плоскирева, Эндо и ВСА, Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов (до 48 часов на ВСА);
в) метод фильтрации: смывную жидкость в объеме 200 мл фильтруют через мембранные фильтры N 3. Фильтры помещают на поверхность питательной среды Плоскирева, Эндо, ВСА (не менее двух чашек каждой из сред). Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов (до 48 часов на ВСА). Дальнейшая идентификация шигелл и сальмонелл (при их обнаружении) проводится по общепринятой схеме.
Остальные фильтры помещают в среды накопления - селенитовый бульон или магниевую среду обычной концентрации, разлитые в пробирку по 10 мл. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. Дальнейший ход исследования идентичен.
6. Питательные среды, реактивы и индикаторы.
18. Среды для накопления:
а) фосфатно - буферный раствор (рН 7,2):
1) раствор А - KH2PO4 - 9,08 г в 1,0 л дистиллированной воды;
2) раствор Б - NaH2PO4 х 12H2O - 11,87 г в 1 л дистиллированной воды.
Приготовление: 150 мл раствора А соединить с 850 мл раствора Б, проверить рН. Раствор готов, если рН 7,2. Если реакция сдвинута в щелочную сторону, надо понемногу добавлять раствор А до тех пор, пока рН не станет 7,2. Если реакция сдвинута в кислую сторону, нужно осторожно добавлять раствор Б до тех пор, пока рН не станет 7,2.
Разливают в пробирки по 10 мл и флаконы по 50 мл. Стерилизуют при 121 °C 30 минут. Является транспортной средой и средой для накопления иерсиний на холоде;
б) жидкая среда Серова:
1) 1% пептонная вода-1000 мл;
2) глюкоза-7,5 г;
3) 0,1% феноловый красный (индикатор)-10 мл.
Приготовление: в 1 литре пептонной воды растворяют 7,5 г глюкозы, добавляют индикатор - феноловый красный 10 мл. Цвет среды ярко-красный (pH 7.4 - 7.5). Приготовление индикатора: 0,1 г фенолового красного растирают в ступке с 2,8 мл 0,1 N раствора NaOH и добавляют 100 мл стерильной дистиллированной воды. Приготовленный раствор должен иметь оранжевый оттенок. Жидкую среду Серова разливают в пробирки по 10 мл или во флаконы по 50 мл и стерилизуют при 110 °C в течение 20 минут. Используют в качестве транспортной и накопительной среды;
в) 10 % желчный бульон:
1) бульон мясопептонный или Хоттингера-900 мл;
2) желчь бычья нативная-100 мл.
Приготовление: рН должен быть равен 7,6. Разливают в стерильные пробирки или флаконы. Стерилизуют при 0,5 атм 30 мин;
г) селенитовый бульон (среда N12): готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке. Для приготовления селенитового бульона двойной концентрации увеличивают навеску сухого препарата в два раза на тот же объем дистиллированной воды;
д) магниевая среда готовят из составных частей:
Раствор 1:
1) пептон - 4,2 г;
2) натрий хлорид (NaCl) - 7,15 г;
3) калий дегидрофосфат (KH2PO4) - 1,49 г;
4) Дрожжевой диализат - 9 мл;
5) Вода дистиллированная - 890 мл;
Раствор 2:
1) Магний хлорид (MgCl2 · 6 H2O) - 35,7 г;
2) Вода дистиллированная - 90 мл;
Раствор 3:
1) Бриллиантовый зеленый 0,5 %;
2) водный раствор - 0,9 мл.
Приготовление: все три раствора в указанных количествах смешивают, разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки. Стерилизуют при 112 °C 30 минут.
19. Среды для выделения культур. Среда для иерсиний, Эндо, Плоскирева (SS-агар), ВСА (висмут-сульфит агар) - выпускаются в сухом виде специализированными биотехнологическими предприятиями. Приготовление сред из сухих препаратов производят в соответствии с указаниями на этикетках.
20. Среды для идентификации патогенных энтеробактерий. Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому, среды Гиса с углеводами, среда с мочевиной по Преусу, среда Симмонса, среда с малонатом натрия, среды с аминокислотами (фенилаланин, лизин, орнитин, аргинин), агар полужидкий для определения подвижности культур, среда Кларка, среда Хью-Лейфсона, среда для определения индолообразования (среда N 15 с триптофаном) и другие биохимические тесты.
Среды промышленного производства готовят в соответствии с указаниями на этикетках, остальные - производят из составных частей согласно правовому акту Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики, регламентирующему унифицированные микробиологические методы исследования в клинической бактериологии.