BAA
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ "МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ
ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ НА ТЕРРИТОРИИ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ"
ПРИКАЗ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
8 февраля 2012 г.
N 83
(САЗ 12-11)
В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 20 декабря 1994 года "О ветеринарной деятельности" (СЗМР 94-4) с изменениями и дополнениями, внесёнными законами Приднестровской Молдавской Республики от 10 июля 2002 года N 152-ЗИД-III (САЗ 02-28), от 3 апреля 2006 года N 18-ЗИД-IV (САЗ 06-15), от 6 июля 2007 года N 253-ЗИ-IV (САЗ 07-28), от 23 сентября 2009 года N 864-ЗИД-IV (САЗ 09-39) с Постановлением Правительства Приднестровской Молдавской Республики от 12 мая 1995 года N 156 "Об утверждении Ветеринарного Устава Приднестровской Молдавской Республики" (САМР 95-5) с Указом Президента Приднестровской Молдавской Республики от 3 апреля 2007 года N 256 "Об утверждении Положения, структуры и штатной численности Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 07-15) с изменениями и дополнениями, внесёнными указами Президента Приднестровской Молдавской от 18 сентября 2007 года N 612 (САЗ 07-39), от 12 января 2008 года N 25 (САЗ 08-1), от 21 мая 2008 года N 308 (САЗ 08-20), от 19 августа 2008 года N 524 (САЗ 08-33), от 30 сентября 2008 года N 636 (САЗ 08-39), от 4 февраля 2009 года N 70 (САЗ 09-6), от 15 июня 2009 года N 410 (САЗ 09-25), от 27 января 2010 года N 40 (САЗ 10-4), от 7 сентября 2010 года N 716 (САЗ 10-36), Указом Президента Приднестровской Молдавской Республики от 18 мая 2011 года N 330 "Об утверждении Положения о Государственной службе ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 11-20), в целях предотвращения распространения болезней общих для человека и животных, приказываю:
1. Утвердить "Методические указания по диагностике бруцеллеза животных на территории Приднестровской Молдавской Республики" (Приложение).
2. Направить настоящий Приказ на государственную регистрацию в Министерство юстиции Приднестровской Молдавской Республики.
3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на начальника Государственной службы ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики Перстнёв А. Ф.
4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
В. ГУМЕННЫЙ
МИНИСТР
г. Тирасполь
8 февраля 2012 г.
N 83 Приложение к Приказу
Министерства здравоохранения
и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 8 февраля 2012 года N 83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
НА ТЕРРИТОРИИ ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
1. Общие положения
1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных. Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входит шесть самостоятельных видов: мелитензис (козье-овечий), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиной), овис (бараний), канис (собачий) и неотома (кустарниковых крыс). Микроорганизмы первых трех видов вызывают бруцеллез, бруцеллы вида овис - заболевание, называемое инфекционным эпидидимитом баранов.
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологических, серологических и аллергических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни.
3. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
а) различные виды возбудителя являются патогенными в основном для животных соответствующего вида, однако бруцеллы видов мелитензис и абортус могут мигрировать и на животных других видов;
б) клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее частое клиническое проявление болезни у маточного поголовья-аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов. При абортах отмечается утолщение плодных оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез нередко сопровождается поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок-эндометрит, вагинит, у самцов-орхит, эпидидимит);
в) патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно (так называемый "миллиарный бруцеллез матки").
4. У баранов, больных инфекционным эпидидимитом, в семенниках и придатках обнаруживают воспалительно-некротические или гнойные очаги различной величины, отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенника.
5. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологические и серологические) исследования материала и аллергические исследования животных в хозяйствах. Плановые серологические и аллергические исследования являются основными методами выявления больных и подозрительных по заболеванию животных. Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочее), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
6. При отборе проб крови, молока и патологического материала, а также при проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и o6cеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
2.Взятие материала от животных и пересылка
его для лабораторных исследований
7. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
8. На бактериологическое исследование на бруцеллез в лабораторию направляют абортированный плод с плодными оболочками (от свиноматок берут не менее 3 плодов) или желудок плода с содержимым (желудок перевязывают со стороны пищевода и со стороны двенадцатиперстной кишки), а также кусочки печени и селезенки.
При взятии содержимого гигром (бурс) в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70°-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70°-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70°-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртово-водного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
9. Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют: от баранов-семенники с придатками; от овцематок - абортированные плоды с плодными оболочками, выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта.
10. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в тот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь для серологи-ческого исследования на бруцеллез.
Если в течение 24-30 часов взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
11. На серологическое исследование в лабораторию направляют кровь (или сыворотку крови) и молоко.
12. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из ушной или хвостовой, у лисиц и песцов - из бедренной вены, у норок - путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста) в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей - по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
13. Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30°С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10°С. Через 20-24 часов отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки (лучше в пробирки Флоринского) и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.
Консервирование сывороток проводят:
а) добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании;
б) сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов;
в) путем однократного замораживания.
Неконсервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 дней со дня взятия крови с сохранением ее при 4-8°С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней замороженные сыворотки - в течение 3 дней после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
14. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу (10-15 мл) цельного свежего молока берут из одного удоя от коровы (буйволицы) в стерильную пробирку. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон фляга и прочее) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
При направлении молока на исследование в лабораторию каждую пробу консервируют добавлением одной капли 10%-ного раствора формалина на 5-10 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 суток. Перед исследованием его необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок. При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции следует проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), страдающих маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных впервые 2 недели после родов.
15. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза
16. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочее), вызывающих подозрение на данное заболевание.
17. Бруцеллы обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и при необходимости путем постановки биологической пробы на морских свинках.
18. Бактериоскопическое исследование:
Из доставленного на исследование патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодных оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные на пламени, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циля-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин. При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.
19. При необходимости определения вида бруцелл, а также в целях дифференциации полевых штаммов от вакцинных выделенные от животных культуры направляют в республиканские, областные, зональные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.
4. Методы серологической диагностики бруцеллеза
20. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных при помощи реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба, РБП) и в молоке коров при помощи кольцевой реакции (КР).
21. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
22. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
23. Компоненты реакции агглютинации:
а) испытуемые сыворотки крови (см. пункт 13 настоящих Методических указаний);
б) позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА и РСК и дату изготовления;
в) негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;
г) антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК;
д) раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный (0,5%-ный) физиологический раствор хлорида натрия (0.85%-ный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5%-ный и оленей - 10%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия.
24. Постановка реакции агглютинации.
а) реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
1) при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
2) крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
3) пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80. При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия (получают разведение сыворотки 1:25). Сыворотку крови овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом, делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго и третьего ряда по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом, делают последовательные двукратные разведения одновременно 10 сывороток. После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50; 1:100; 1:200 и 1:400; 1:25; 1:50; 1:100 и 1:200 или 1:10; 1:20; 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
б) при постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли:
1) с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
2) с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37-38°С на 16-20 часов, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
25. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по следующей схеме:
а) (++++) - полное просветление жидкости, микробные тела антигена осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
б) (+++) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик" (75% агглютинации);
в) (++) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен (50% агглютинации);
г) (+) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
д) (-) - просветления жидкости и образования "зонтика" не наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших микробов антигена, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME, 1:200-200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 0, 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первых пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания жидкость из каждой пробирки переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой, пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при поставке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведениях, исследуют повторно в четырех разведениях.
26. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME антител); коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного исследуют повторно через 3-4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах (например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более - "сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.
27. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК).
28. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
29. Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике инфекционного эпидидимита баранов.
30. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
а) испытуемые сыворотки крови (см. пункт 13 настоящих Методических указаний);
б) позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату изготовления;
в) негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК - при 60-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов - при 64-65°С, буйволов - при 62-64°С в течение 30 мин, свиней - при 60-62°С в течение 50 мин) для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63-64°С в течение 30 мин; антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре, указанном предприятием его изготовившим; комплемент-сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4% - борной кислоты или лиофильно высушенная).
При использовании в качестве комплемента свежей или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности.
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при 2-4°С; гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК в утроенном. Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой новой серии; эритроциты барана - 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе для РСК и 3%-ная для РДСК.
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в термостате при 37°С в течение 15-20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь эритроцитов; физиологический раствор - 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде рН 7,3-7,4 или физиологический раствор содержащий ионы магния и кальция.
Рабочие разведения всех компонентов для РСК и РДСК готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме. В реакции используют компоненты, не обладающие антникомплементарными и гемотоксическими свойствами.
31. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37-38°С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента - сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериологической системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных, которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора), инактивируют, как указано в пункте 30,и разливают по 0,2 мл в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сыворотки вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки ставят в водяную баню при 37-З8°С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, встряхивают их, вновь ставят в водяную баню на 20 мин, после чего учитывают результат.
Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин в водяной бане при 37-38°С, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном.
32. Проведение главного опыта:
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном.
а) необходимые разведения сывороток рекомендуется готовить следующим образом:
1) при исследовании в одной пробирке берут 0,04 мл испытуемой сыворотки и добавляют 0,16 мл физиологического раствора (разведение 1:5). Допускается при работе с аппаратом Флоринского к 0,05 мл испытуемой сыворотки добавлять 0,2 мл физраствора;
2) при постановке реакции в трех пробирках в первую наливают 0,1 мл испытуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки 0,2 мл переносят во вторую и 0,1 мл - в третью, в которую затем добавляют 0,1 мл физиологического раствора (разведение 1:10);
3) инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в пункте 30, разлив сывороток, физиологического раствора и других компонентов реакции проводят при помощи пипеток или аппарата Флоринского.
б) главный опыт сопровождается следующими контролями:
1) негативная и бруцеллезная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);
2) гемолитическая система (0,6 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы).
33. Постановка реакции длительного связывания комплемента.
РДСК на холоде проводят в пробирках в объеме сыворотки, антигена и комплемента по 0,2 мл, гемолитической системы в оттитрованной рабочей дозе.
Последовательность постановки РДСК:
а) первый день - разлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической системы, инактивирование сывороток, контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность; разлив антигена и комплемента; приготовление гемолитической системы; помещение пробирок в холодильник;
б) второй день - выдерживание пробирок главного опыта и гемолитической системы при комнатной температуре 20 мин, титрование гемолитической системы, определение рабочей дозы гемолитической системы;
в) главный опыт: разлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками;
г) учет и оценка результатов реакции.
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Необходимые разведения сывороток готовят в порядке, как указано в пункте 31 настоящих Методических указаний. Инактивирование разведенных сывороток крови проводят, как указано в пункте 30 настоящих Методических указаний.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при титре в гемсистеме, указанном биопредприятием -0,19-0,22).
Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр - на один интервал ниже (например, при титре гемолитической системы 0,6 мл, рабочий титр - 0,5 мл).
Контроли реакции: негативная и позитивная (бруцеллезная или овисная) сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена, гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.
34. Учет результатов РСК и РДСК проводят визуально.
При постановке реакций в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани; при исследовании в трех пробирках - через 3-4 часа, когда в контрольных пробах с позитивной (бруцеллезной или овисной) сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).
Результаты реакций оценивают в крестах по следующей схеме:
(++++) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;
(+++) - гемолиз 25% эритроцитов;
(++) - гемолиз 50% эритроцитов;
(+) - гемолиз 75% эритроцитов;
(-) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Степень задержки гемолиза эритроцитов определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну. Из этой жидкости готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:
-------------------------------------------------------------------
| N | | | | | | |
| п/п | Номера пробирок | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| | | | | | | |
|-----|---------------------------|-----|------|-----|------|-----|
| 1. | Гемолизированная жидкость | 1.0 | 0.75 | 0.5 | 0.25 | - |
|-----|---------------------------|-----|------|-----|------|-----|
| 2. | Физиологический раствор | - | 0.25 | 0.5 | 0.75 | 1.0 |
|-----|---------------------------|-----|------|-----|------|-----|
| 3. | Процент гемолиза | 100 | 75 | 50 | 25 | 0 |
-------------------------------------------------------------------
Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в пробирках шкалы и процент гемолиза выражают в крестах.
35. Диагностическая оценка РСК и РДСК. При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном) все сыворотки, давшие задержку гемолиза на один крест и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.
Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена); сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15-30 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная РСК (РДСК), считают реагирующими положительно.
36. Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток по каждой экспертизе, номера серий, сроки годности антигена, комплемента, гемолизина и их рабочие титры записывают в журнал серологических исследований.
В заключении лаборатории о результатах исследования сывороток крови животных указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и показания реакции в крестах.
37. Постановка и учет результатов пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба, или РБП).
38. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП) применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей.
39. Компоненты РБП:
а) испытуемые сыворотки крови (см. пункт 13 настоящих Методических указаний);
б) бруцеллезный антиген, окрашенный бенгальским розовым (роз бенгал антиген);
в) позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;
г) 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор.
40. Постановка РБП.
Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18 - 30°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.
Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата (ШПРБ-1) или микропипетки. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным физиологическим раствором и кончик подсушивают фильтровальной бумагой.
При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы вносят 0,03 мл антигена, а при исследований сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей - 0,015 мл антигена. Затем антиген тщательно в каждой лунке смешивают с сывороткой активными движениями ручного полисмесителя до получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток каждого ряда лунок (смесителем на 5 проб) или во всех лунках пластинки (смесителем на 25 проб) смеситель ополаскивают фенолизированным физиологическим раствором и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.
Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной (с активностью 100-200 ME) сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).
41. Учет результатов реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).
После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением их на 5 мин в 3%-ный раствор фенола, затем тщательно моют водопроводной водой, высушивают на воздухе и используют повторно. Для проведения дезинфекции и сушки пластинок используют кассеты и штативы-сушилки.
При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование данной сыворотки и по результатам его дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
42. Диагностическая оценка РБП.
При получении положительного результата РБП при исследовании сывороток крови животных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки, с которыми получена положительная РБП, в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК не исследуют.
Диагностическую оценку результатов исследования сывороток крови в РБП проводят по следующей схеме. В случае получения положительного результата РБП при исследовании сывороток крови животных в неблагополучных по бруцеллезу стадах (на фермах, в хозяйствах, населенных пунктах) овец, коз, свиней и северных оленей признают больными бруцеллезом, а сыворотки крови крупного рогатого скота, буйволов, лошадей и верблюдов дополнительно исследуют в РА и РСК. Диагностическую оценку результатов исследования сывороток в РБП в этом случае проводят по схеме, приведенной ниже.
Результаты реакций:
----------------------------------------------------------------------------
| N | РБ | РА | РСК(РДСК) | Диагностическая |
| п/п | | | | оценка |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 1. | Положительная | Положительная | Положительная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 2. | Положительная | Положительная | Сомнительная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 3. | Положительная | Положительная | Отрицательная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 4. | Положительная | Сомнительная | Положительная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 5. | Положительная | Сомнительная | Сомниетльная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 6. | Положительная | Сомнительная | Отрицательная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 7. | Положительная | Отрицательная | Положительная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 8. | Положительная | Отрицательная | Сомнительная | Положительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 9. | Положительная | Отрицательная | Отрицательная | Сомнительная |
|------|---------------|----------------|----------------|-----------------|
| 10. | Отрицательная | Не исследуется | Не исследуется | Отрицательная |
----------------------------------------------------------------------------
В заключении лаборатории о результатах исследований сообщают диагностическую оценку (положительная, сомнительная, отрицательная) и указывают показания всех реакций. Например, "положительная (РБП положительная, РА 200 ME, РСК++)"; "сомнительная (РБП положительная, РА -, РСК -)".
При диагностической оценке "сомнительная" сыворотку крови данного животного повторно исследуют через 15-30 дней в РБП, РА и РСК (РДСК). При получении положительных или вновь сомнительных показаний реакций результат исследования оценивают положительно.
43. Постановка и учет кольцевой реакции с молоком (КР).
44. Кольцевую реакцию применяют с целью проверки благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.
Исследование молока на бруцеллез в КР проводят непосредственно в хозяйствах, в ветеринарных лабораториях, на мясомолочных и пищевых контрольных станциях.
Исследование молока в КР разрешается проводить только ветеринарным врачам лабораторий, мясомолочных и пищевых контрольных станций и ветеринарным врачам хозяйств, прошедшим при лабораториях специальную подготовку по постановке и учету реакции.
45. Компоненты реакции:
а) исследуемое молоко (см. пункт 14 настоящих Методических указаний);
б) антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком;
в) сыворотка позитивная бруцеллезная.
46. Постановка кольцевой реакции.
Уленгутовские пробирки устанавливают в резиновые штативы и нумеруют в соответствии с описью проб молока. В пробирки разливают по 0,05 мл антигена, затем шприцем с иглой длиной 50-60 мм, нажимая на поршень слабыми толчками, вливают в них по 1 мл молока и тщательно смешивают его с антигеном. Пocлe каждой пробы молока шприц двукратно промывают теплой водой.
При постановке КР в пробирках Флоринского или серологических берут по 2 мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.
При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы (буйволицы); со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока).
Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37 - 38°С на 1час.
47. Учет и оценка результатов кольцевой реакции.
Результаты реакции учитывают визуально сразу после извлечения штативов из водяной бани (термостата) по следующей схеме (в крестах)
(+++) - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок (остальная часть молока остается белой);
(++) - достаточно выраженное синее кольцо в слое сливок (остальная часть молока имеет синеватый цвет);
(+) - синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;
(-) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок - белого или слегка желтоватого цвета.
Все пробы молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, а с оценкой 1 крест - сомнительными.
При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.
При получении отрицательных результатов исследования сывороток крови в РБП или в РА и РСК (РДСК) у всех животных данное стадо считают благополучным по бруцеллезу, а животных, с молоком которых получена положительная КР, оставляют в стаде.
В случае получения положительных результатов исследования на бруцеллез крови с животными стада поступают в соответствии с инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных. При этом изолируют также и животных, выделенных при исследовании молока в КР, если эта реакция не была связана с другим заболеванием животных.